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享 | 冷凍電鏡領(lǐng)航阿爾茲海默病候選藥物的發(fā)現和優(yōu)化

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阿爾茨海默?。ˋD)是最主要的神經(jīng)退行性疾病,Aβ(特別是Aβ42)是導致AD的重要成因。γ-secretase在A(yíng)β的生成過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用,因此一直被人們視作抗AD藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。然而,分子量高達230kDa、多次跨膜且高度糖基化的γ-secretase給傳統結構解析方法提出了重大挑戰。近些年,施一公團隊應用Cryo-EM SPA技術(shù)以3.4 ?分辨率解析γ-secretase的結構,并進(jìn)一步解析了4種靶向藥物與γ-secretase結合形成復合物的結構,為新一代藥物的發(fā)現和優(yōu)化提供了重要啟示。



- 01 -



γ-secretase是抗AD藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)


阿爾茨海默?。?/span>Alzheimer’s Disease, AD)是全球最主要的神經(jīng)退行性疾病,患病人群的規模龐大。淀粉樣斑塊沉積是AD的兩大病理特征之一,這些斑塊主要由β-淀粉樣小肽(β-amyloid, Aβ)沉積形成。自1991年發(fā)現淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)突變參與家族性ADFAD)發(fā)病以來(lái),淀粉樣蛋白級聯(lián)假說(shuō)就逐漸成為AD發(fā)病機理的主流理論,而早老素1Presenilin 1, PS1)突變體的發(fā)現進(jìn)一步支持了這一假說(shuō)[1]。


APP經(jīng)由淀粉樣生成途徑被分泌酶切割產(chǎn)生的片段。在該途徑中,APPN端在質(zhì)膜的胞外側首先被β-分泌酶(β-secretase)切割,然后其C端的99個(gè)氨基酸殘基(C99)會(huì )進(jìn)一步被γ-分泌酶(γ-secretase)切割,產(chǎn)生胞內域和一個(gè)包含4849個(gè)殘基的跨膜區短肽(Aβ48Aβ49)。Aβ48Aβ49可繼續被γ-secretase以消化34個(gè)殘基的方式切割。其中Aβ49被切割后產(chǎn)生Aβ46,Aβ43Aβ40。而Aβ48被切割后產(chǎn)生Aβ45,Aβ42Aβ38[2]。人體中存在的最主要形式是Aβ40Aβ42。由于這些片段幾乎包含了APP這一單次跨膜蛋白的整個(gè)跨膜區段而具有很強的疏水性,所以極易聚集并在體內形成淀粉樣纖維,進(jìn)而沉積形成淀粉樣斑塊。其中,Aβ42Aβ43最容易聚集并產(chǎn)生神經(jīng)毒性,從而引起AD[3]。


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圖1. Aβ單體主要在神經(jīng)元內體中產(chǎn)生并外排至細胞間質(zhì)中逐步聚集
(Justin M. Long and David M. Holtzman1, 2019)


人源γ-secretasePresenilin, Aph-1, Pen-2Nicastrin4個(gè)亞基組成,其中Presenilin構成了執行酶活性的功能亞基,它具有PS1PS2兩個(gè)同源異構體。目前在PS1, PS2APP上鑒定出200多個(gè)突變與AD相關(guān),絕大部分都集中在PS1[4]。這些突變中的大部分突變導致APP不正常切割,致使生成變多或者Aβ42/Aβ40的比率升高[5]。這些發(fā)現表明(特別是Aβ42)是導致AD的重要成因。在這個(gè)假設前提下,如能夠抑制或者調節γ-secretase的切割活性,或許能夠減少的產(chǎn)生,達到治療AD的目的[6]。因此理解γ-secretase的分子機理以及藥物對γ-secretase的作用機制極為關(guān)鍵。


- 02 -


冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)解決γ-secretase結構解析重大難題

同其他多次跨膜膜蛋白一樣,科學(xué)家們在很長(cháng)時(shí)間內都無(wú)法得到生長(cháng)良好的γ-secretase蛋白晶體,因此很難通過(guò)X-Ray衍射這一傳統技術(shù)獲得γ-secretase的高分辨率結構。同時(shí),面對分子質(zhì)量高達230kDa,具4個(gè)亞基且高度糖基化的成熟γ-secretase,NMR分析也同樣力不從心。2013年程亦凡教授與David Julius博士合作,率先應用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)(Cryo-EM Single Particle Analysis, Cryo-EM SPA)解析了TRPV1蛋白結構[7],并將其分辨率提升到近原子級別的3.4 ?,為Cryo-EM在結構領(lǐng)域的應用帶來(lái)了重大突破。同時(shí)也讓人們意識到,Cryo-EM很可能成為解決高分子量多次跨膜蛋白結構解析難題的新一代技術(shù)。


2015年,施一公團隊率先在Nature上發(fā)表文章,報告了應用Cryo-EM SPA技術(shù)解析的γ-secretase近原子級蛋白結構,分辨率達到?3.4 ?[8]。在2018-2019年,施一公團隊又先后在NatureScience上發(fā)表文章,利用冷凍電鏡解析了人源γ-secretase識別并結合NotchAPP的結構基礎,關(guān)鍵區域分辨率分別達到2.7 ?2.6 ?[9,10]。


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2.?人源γ-secretase近原子級結構?(Bai.X.-C., et al. 2015)


- 03?-


冷凍電鏡高效解析候選藥物與γ-secretase復合物結構,領(lǐng)航新一代藥物研發(fā)


γ-分泌酶抑制劑(GSI)和調節劑(GSM)的開(kāi)發(fā)為AD提供了富有前景的治療機會(huì )。但這些GSIGSM如何靶向γ-secretase仍然未知。2021年施一公團隊在Cell上發(fā)表新文章,再次應用Cryo-EM SPA解析了4種候選分子與γ-secretase復合物結構[11]。文章報告γ-secretase分別與3GSISemagacestat, Avagacestat和過(guò)渡狀態(tài)類(lèi)似物L458)或1GSME2012)結合復合物結構,分辨率2.6–3.1?,均達到近原子級別。值得注意的是,每個(gè)GSIPS1上均占據底物位置,從而干擾底物的募集。而E2012可與γ-secretase別構位點(diǎn)結合,這可能解釋了其調節活性。這些基于冷凍電鏡的結構解析工作,有望指導基于藥物構效關(guān)系(Structure Activity Relationship, SAR)的下一代靶向γ-secretase藥物的開(kāi)發(fā)。


本研究首先在體外驗證了課題組純化的重組γ-secretase的活性,并使用Alpha Lisa Assay測量不同條件重組γ-secretase切割C99生成Aβ40的活性,用于評估3GSI靶向生成的抑制作用。之后解析γ-secretase分別結合Semagacestat, Avagacestat,L458E2012后形成的復合物電鏡結構。SemagacestatEli Lily開(kāi)發(fā),是第一個(gè)進(jìn)入III期臨床評估的GSI[12]。與令人鼓舞的早期結果相反[13],Semagacestat未顯示預期的認知改善,卻產(chǎn)生嚴重副作用[14],這歸因于Semagacestat抑制了γ-secretaseNotch等其他重要底物的水解[15]。


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3.?人源γ-secretase結合Semagacestat的結構基礎?(原文圖2)


結構解析結果顯示:Semagacestat的結合位點(diǎn)與APP-C99Notch-100β-鏈完全相同,位于PS1胞內側的深腔中(圖3, A)。該發(fā)現為Semagacestat抑制γ-secretase的活性提供了直接且令人滿(mǎn)意的解釋。Semagacestat占據該位點(diǎn)可能阻礙PS1和底物間雜化β-片層形成,從而抑制γ-secretase水解底物。SemagacestatPS1K380L432的主鏈形成4個(gè)氫鍵(圖3, D左),這兩個(gè)殘基在γ-secretase識別C99Notch -100時(shí)同樣發(fā)揮重要作用[9,10],提示SemagacestatPS1結合模式與PS1的天然底物相似。此外,Semagacestat上芳香環(huán)和甲基還與PS1疏水殘基的側鏈接觸并形成生范德華力,但仍然留下了幾個(gè)小縫隙(圖3)。若在這些縫隙中填充其他疏水基團,以填充SemagacestatV261V272周?chē)氖杷臻g,可能提高新一代抑制分子的特異性和抑制能力。


為了解決Semagacestat底物選擇性差、毒副作用顯著(zhù)的問(wèn)題,Avagacestat作為具有底物選擇性的GSI而被開(kāi)發(fā)。相比于Semagacestat,Avagacestat選擇性抑制PS1C99的水解,作用比底物為Notch時(shí)強約3-193[16]。盡管如此,高劑量的Avagacestat仍然會(huì )抑制PS1Notch的水解并顯示毒性。Avagacestat的結合模式如何賦予其底物選擇性是個(gè)非常有價(jià)值的研究問(wèn)題。復合物的結構顯示,雖然AvagacestatSemagacestat的化學(xué)性質(zhì)完全不同,AvagacestatSemagacestat結合位點(diǎn)完全相同(圖4, B)。因此Avagacestat同樣占據PS1底物結合位點(diǎn),阻止雜化β-片層的形成從而抑制γ-secretase的活性。


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4.?人源γ-secretase結合Avagacestat的結構基礎?(原文圖3)


但Avagacestat的具體結合模式與Semagacestat存在很大的區別,這可能是其抑制作用底物選擇性的原因。Avagacestat主要與PS1疏水殘基互作,只與G382主鏈酰胺基形成1個(gè)氫鍵(圖4, C)。Avagacestat三氟戊酰胺基(圖4, A中Thumb區)位于PS1 N端(NTF)V261,L268和V272構成的疏水口袋(圖4, C左)。Avagacestat氯苯基(圖4, A中Index區)結合在PS1 C端(CTF)與L418,T421,L425和A434間形成范德華力(圖4, C右)。Avagacestat惡二唑氟芐基(圖4, AStem區)一側與PS1結合(圖3D,左),另一側在空間上相對裸露,因此可用于進(jìn)一步修飾(圖3D,右中綠色圈),以增強抑制強度和特異性。


SemagacestatAvagacestat不同,L458是一種競爭性過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物抑制劑(TSA)。L458直接結合PS1活性位點(diǎn),在空間上大致與SemagacestatAvagacestat相同(圖5, B)。?L458和位于催化中心的2個(gè)天冬氨酸(D257, D385)同時(shí)形成氫鍵,并與與PS1上的其他氨基酸形成另外的5個(gè)氫鍵(圖5, C),還能同周?chē)氖杷畾埢纬煞兜氯A力(圖5, D)。相較于非TSA抑制劑,L458可以與PS1催化位點(diǎn)上方的口袋進(jìn)一步結合,以加固抑制劑與催化殘基D257D385之間的氫鍵。

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5.?人源γ-secretase結合L458的結構基礎?(原文圖5)

GSI以外,GSM也被公認為是一類(lèi)有吸引力的小分子。GSM很可能會(huì )促進(jìn)Aβ42的進(jìn)一步切割,從而減少易于聚集的的產(chǎn)量[17]。與GSI不同,GSM在遠離活性位點(diǎn)的別構位點(diǎn)處識別并結合γ-secretase。這提示我們,特定GSI可與GSM配合使用并發(fā)揮協(xié)同作用,進(jìn)而實(shí)現底物選擇性抑制。2013年,Pozdnyakov等曾報道L458可以增強E2012γ-secretase的結合力[17]。


體外孵育實(shí)驗表明,單獨使用5 nM?L45850 mM GSM E2012時(shí)僅導致γ-secretase水解C99活性的溫和抑制,而二者聯(lián)用卻能幾乎完全抑制水解(圖6, A)。為闡釋L458E2012γ-secretase活性調節的協(xié)同作用,團隊以2.6?的分辨率獲得了同時(shí)與E2012L458結合的重組人源γ-secretase的冷凍電鏡結構。E2012插入PS1NCT界面處的疏水口袋中,并與PS1loop-1互作(圖6, C),覆蓋部分底物結合通道(圖6, D),從而調節γ-secretase對不同底物的活性。將結合E2012的γ-secretaseAPP片段復合起來(lái),發(fā)現E2012C99N端發(fā)生沖突(圖6, F&G),這種沖突可能使C99募集更困難或促進(jìn)C99的解旋退繞。后者可導致C99進(jìn)一步向下移動(dòng)到PS1活性位點(diǎn),并增加將切割成較短片段的可能性。先前的研究也已證明:存在E2012時(shí)Aβ40Aβ42產(chǎn)量降低,而Aβ38產(chǎn)量升[17]。


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6.?人源γ-secretase結合E2012的結構基礎?(原文圖5)



- 總結 -


時(shí)至今日,科學(xué)家們?yōu)榱斯タ薃D已經(jīng)積累了幾十年的努力。然而我們尚未發(fā)現任何一種手段可以有效緩解疾病,甚至連延緩認知障礙的進(jìn)展都很難做到。這在很大的程度上和AD病因不完全明確、相關(guān)生物大分子的結構和功能尚未被完全闡明有關(guān)。施一公團隊這項工作應用Cryo-EM SPA技術(shù),在近原子分辨率上解析了γ-secretase與多種小分子結合后形成復合物的結構。有關(guān)結果一方面進(jìn)一步揭示了現有先導化合物或第一代藥物分子的作用機制,另外一方面也可以啟發(fā)研發(fā)人員基于結構對藥物分子進(jìn)行優(yōu)化設計。隨著(zhù)技術(shù)的不斷進(jìn)步,Cryo-EM SPA技術(shù)的解析分辨率已經(jīng)可以達到3?以下,有關(guān)文章在近年也呈現爆發(fā)式增長(cháng)。今后,冷凍電鏡必將成為藥物發(fā)現和優(yōu)化的強大助力,為守護人類(lèi)健康做出更大貢獻。


???// 參考文獻


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水木未來(lái)(北京)科技有限公司是一家結構和計算驅動(dòng)的新型藥物研發(fā)公司,擁有亞太區第一個(gè)商業(yè)化冷凍電鏡服務(wù)平臺,基于冷凍電鏡、計算化學(xué)、機器學(xué)習和高性能計算核心技術(shù),在小分子、抗體藥、蛋白降解、基因治療等領(lǐng)域推動(dòng)數字化創(chuàng )新,助力全球創(chuàng )新藥企大幅提升藥物研發(fā)效率和成功率。

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